賽默飛3500系列分析儀根據(jù)通道數(shù)量分為3500(8通道)與3500xL(24通道)兩種常用型號(hào)。無(wú)論哪一型號(hào),其主要核心模塊包括以下幾部分:
用于DNA片段的分離;
材質(zhì)為石英毛細(xì)管,標(biāo)準(zhǔn)長(zhǎng)度36cm;
通道數(shù)量決定一次可并行檢測(cè)的樣本數(shù)量。
采用多色激光激發(fā),能同時(shí)檢測(cè)多種熒光標(biāo)記;
具備高度靈敏的CCD檢測(cè)器;
支持多種熒光染料組合,如DS-30、DS-33、G5等。
通過(guò)自動(dòng)泵送方式將高分子聚合物注入毛細(xì)管;
常用聚合物類(lèi)型包括POP-4、POP-6與POP-7;
可自動(dòng)監(jiān)測(cè)聚合物余量,提示更換。
配備樣本盤(pán)與反應(yīng)板模塊;
支持384孔微孔板或96孔PCR板;
自動(dòng)控制進(jìn)樣電壓與進(jìn)樣時(shí)間。
毛細(xì)管電泳區(qū)具有恒溫系統(tǒng),常設(shè)60°C;
高壓電泳電源輸出穩(wěn)定,確保片段分離清晰。
樣本DNA需純度高(A260/A280 ≈1.8);
濃度范圍通常控制在10-50 ng/μL;
可采用磁珠法、柱提法或酚氯仿法進(jìn)行提取。
成分 | 體積 | 備注 |
---|---|---|
PCR Master Mix | 5 μL | 含Taq酶、緩沖液、dNTPs等 |
引物混合液(帶熒光) | 1 μL | 上游或下游帶FAM/VIC等標(biāo)記 |
樣本DNA模板 | 1 μL | 濃度建議不超過(guò)30 ng |
超純水 | 3 μL | 調(diào)整總體積 |
預(yù)變性:95°C,5分鐘;
變性:95°C,30秒;
退火:55~60°C,30秒;
延伸:72°C,45秒;
循環(huán):30~35次;
終末延伸:72°C,5分鐘;
4°C保存待用。
每個(gè)上樣孔中需加入:
成分 | 體積 | 說(shuō)明 |
---|---|---|
Hi-Di Formamide | 9.5 μL | 電泳專(zhuān)用去離子甲酰胺溶液 |
ROX Size Standard | 0.5 μL | 內(nèi)標(biāo)大小標(biāo)準(zhǔn)(如GeneScan 600) |
PCR產(chǎn)物 | 1 μL | 按需加入 |
混合后充分離心,在95°C加熱2分鐘,迅速冰浴處理,確保樣品變性狀態(tài)一致。
毛細(xì)管長(zhǎng)度:36cm;
聚合物類(lèi)型:POP-7;
電泳緩沖液:1× Genetic Analyzer Buffer with EDTA;
進(jìn)樣電壓:1.2 kV;
進(jìn)樣時(shí)間:15秒;
電泳電壓:13.0 kV;
分離時(shí)間:1550秒;
毛細(xì)管溫度:60°C;
樣品板溫度:4°C。
耗材名稱(chēng) | 功能用途 |
---|---|
毛細(xì)管陣列 | DNA片段電泳分離核心通道 |
聚合物POP系列 | 分離介質(zhì) |
Hi-Di Formamide | 上樣溶劑,防止樣品沉淀或團(tuán)聚 |
緩沖液(10×) | 保持電泳系統(tǒng)電導(dǎo)穩(wěn)定 |
熒光引物混合液 | 實(shí)現(xiàn)多重標(biāo)記檢測(cè) |
ROX 500/600標(biāo)準(zhǔn)品 | 片段大小校準(zhǔn)內(nèi)參 |
聚合物需4°C保存,避免反復(fù)凍融;
ROX標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)避光、冷凍存儲(chǔ);
Formamide每次開(kāi)封應(yīng)盡快使用,避免氧化降解;
使用過(guò)的毛細(xì)管陣列如出現(xiàn)信號(hào)衰減應(yīng)及時(shí)更換。
用于儀器控制、運(yùn)行方案編輯與樣品管理;
可設(shè)定進(jìn)樣方式、樣本順序、電泳時(shí)間等;
提供運(yùn)行監(jiān)控界面,實(shí)時(shí)顯示狀態(tài)信息。
自動(dòng)峰識(shí)別、大小標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn);
可設(shè)置分析模板,快速進(jìn)行STR或SNP分析;
輸出圖譜清晰、峰形整齊,具備高精度分辨率。
支持導(dǎo)出.fsa格式原始數(shù)據(jù);
可連接LIMS系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)自動(dòng)記錄;
兼容第三方法醫(yī)或突變檢測(cè)軟件處理。
室溫控制在18~25°C;
相對(duì)濕度不超過(guò)60%,防止聚合物變質(zhì);
配備UPS不間斷電源,防止實(shí)驗(yàn)中斷。
維護(hù)內(nèi)容 | 建議頻率 | 操作說(shuō)明 |
---|---|---|
聚合物更換 | 每使用120樣品或14天 | 系統(tǒng)提示更換時(shí)立即處理 |
緩沖液更換 | 每次運(yùn)行前 | 確保離子濃度足夠,避免電泳失敗 |
毛細(xì)管沖洗 | 每周至少1次 | 避免毛細(xì)管堵塞、信號(hào)下降 |
清潔廢液瓶與排液管 | 每周 | 防止廢液倒流污染電泳系統(tǒng) |
軟件校準(zhǔn)檢測(cè) | 每月 | 確保峰位識(shí)別準(zhǔn)確 |
避免在運(yùn)行時(shí)打開(kāi)前艙門(mén);
聚合物與Formamide屬有機(jī)溶劑,應(yīng)佩戴手套操作;
禁止操作時(shí)食用、飲水或用嘴吹液體;
使用后及時(shí)密封所有耗材,避免污染和降解。
現(xiàn)象 | 原因分析 | 處理建議 |
---|---|---|
電泳圖無(wú)峰 | 樣本未上樣或聚合物堵塞 | 檢查樣本準(zhǔn)備流程、清洗毛細(xì)管 |
峰形模糊或拖尾 | 聚合物老化或毛細(xì)管污染 | 更換聚合物或重新沖洗陣列 |
峰高信號(hào)弱 | 引物標(biāo)記不足、模板濃度低 | 優(yōu)化PCR反應(yīng)條件,適量加樣 |
尺寸標(biāo)準(zhǔn)偏移或錯(cuò)位 | 標(biāo)準(zhǔn)品老化、軟件校準(zhǔn)異常 | 更換ROX標(biāo)準(zhǔn)并校正方法參數(shù) |
軟件無(wú)法識(shí)別進(jìn)樣盤(pán) | 樣本板未對(duì)齊或識(shí)別標(biāo)簽出錯(cuò) | 重新安裝樣本板并確認(rèn)樣品信息 |
為了獲得更高一致性與可重復(fù)性,推薦如下實(shí)驗(yàn)配置優(yōu)化措施:
采用統(tǒng)一批次試劑、耗材,減少批間差異;
設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照樣本或陽(yáng)性模板,便于判斷系統(tǒng)性能;
所有實(shí)驗(yàn)流程操作人員應(yīng)接受統(tǒng)一培訓(xùn);
對(duì)每輪實(shí)驗(yàn)運(yùn)行結(jié)果進(jìn)行記錄歸檔,便于追溯分析;
若開(kāi)展多重PCR或STR檢測(cè),建議根據(jù)峰強(qiáng)、片段長(zhǎng)度優(yōu)化引物濃度比例。
賽默飛3500基因分析儀是一套高度自動(dòng)化、性能成熟的電泳系統(tǒng),但其運(yùn)行效果極大依賴(lài)于實(shí)驗(yàn)配置的精準(zhǔn)與操作的規(guī)范。通過(guò)合理選擇聚合物、電泳參數(shù)、上樣比例及配套軟件,結(jié)合日常維護(hù)與科學(xué)管理,可以大幅提升實(shí)驗(yàn)通量與結(jié)果可信度。希望本文能為廣大用戶在配置設(shè)備與開(kāi)展實(shí)驗(yàn)過(guò)程中提供切實(shí)可行的參考。